Voici quelques informations et conseils pour vous guider dans le design de vos immunomarquages.
Tutoriels et documents utiles
- Tissue Controls & More for Immunohistochemistry (CSTTechTips)
- How to perform Antigen retrieval (AR) in Immunohistochemistry (IHC) (CSTTechTips)?
- How does antibody diluent affect staining in Immunohistochemistry (IHC) (CSTTechTips)?
- 5 Tips to Start Your Multiplex IHC Optimization (CSTTechTips)
- Multiplex IHC Optimization: Antibody Titration & Fluorophore Pairing (CSTTechTips)
- HC world FAQ
- Troubleshootong tips (SABbiotech)
- Optimisation IHC/ICC (webinar Abcam)
- HC/ICC simple ou multiples marqueurs (webinar Abcam)
Conseils pour l'optimisation des protocoles
- Vérifiez les recommandations indiquées sur la datasheet et dans la littérature
- Vérifiez les solutions (pH, précipitation, âge,...). Les anticorps n'aiment pas la cristallisation --> diluez-les dans 50% de glycérol stérile pour une conservation à -20°C
- Commencez avec un protocole classique sur des contrôles + et - avec 3 dilutions d'Ac (entre 1 et 10 µg/ml)
- N'hésitez pas à bien rincer vos lames!!
Quels contrôles réaliser ?
Contrôles positifs
quoi ?
- tissu, cellules, culots de cellules (préparés de la même façon vos échantillons)
- autre Ac primaire
- autre technique de détection
que vérifier ?
- localisation du marquage (type cellulaire, compartiment subcellulaire)
- utiliser, si nécessaire, un co-marquage avec des marqueurs d'organelles ou des marqueurs spécifiques d'un type cellulaire
Contrôles négatifs
Fixation spécifique de l'Ac primaire ?
- +++ souris/cellules KO +++ (vérifiez les épitopes s'il s'agit de protéines tronquées)
- Peptide bloquant
Fixation spécifique des réactifs de révélation (Ac secondaire, substrat) ?
- Omission de l'Ac primaire
- Isotype contrôle
- Pour les multiplex: chaque Ac primaire + tous les Ac secondaires (commandez des Ac secondaire cross-adsorbés!!)