Conseils pour immunomarquages (IHC-IHF-IC/IF)

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Voici quelques informations et conseils pour vous guider dans le design de vos immunomarquages.

  • Tutoriels et documents utiles

- Tissue Controls & More for Immunohistochemistry

- How to perform Antigen retrieval (AR) in Immunohistochemistry (IHC)?

- How does antibody diluent affect staining in Immunohistochemistry (IHC)?

- 5 Tips to Start Your Multiplex IHC Optimization

- Multiplec IHC Optimization: Antibody Titration & Fluorophore Pairing

 

IHC world FAQ

Optimisation IHC/ICC (webinar Abcam)

IHC/ICC simple ou multiples marqueurs (webinar Abcam)

  • Conseils pour l'optimisation des protocoles

- Vérifiez les recommandations indiquées sur la datasheet et dans la littérature

- Vérifiez les solutions (pH, précipitation, âge,...)

Les anticorps n'aiment pas la cristallisation --> diluez-les dans 50% de glycérol stérile pour une conservation à -20°C

- Commencez avec un protocole classique sur des contrôles + et - avec 3 dilutions d'Ac (entre 1 et 10 µg/ml)

- N'hésitez pas à bien rincer vos lames!!

 

  • Quels contrôles réaliser?

 

- Contrôles positifs

quoi?

tissu, cellules, culots de cellules (préparés de la même façon vos échantillons)

autre Ac primaire

autre technique de détection

que vérifier?

localisation du marquage (type cellulaire, compartiment subcellulaire)

utiliser, si nécessaire, un co-marquage avec des marqueurs d'organelles ou des marqueurs spécifiques d'un type cellulaire

- Contrôles négatifs

fixation spécifique de l'Ac primaire?

+++ souris/cellules KO +++ (vérifiez les épitopes s'il s'agit de protéines tronquées)

peptide bloquant

fixation spécifique des réactifs de révélation (Ac secondaire, substrat)?

omission de l'Ac primaire

isotype contrôle

pour les multiplex: chaque Ac primaire + tous les Ac secondaires (commandez des Ac secondaire cross-adsorbés!!)