Quelles analyses effectuons-nous ?
1) Confirmation d'identification
Le test consiste
- à mettre en évidence la présence d'un Clostridioides difficile dans un échantillon ou de confirmer l'identification de la souche envoyée par mise en culture (ChromiD, Biomérieux).
- à rechercher la GDH (Glutamate déhydrogénase) dans les selles ou sur culture par test immuno-enzymatique (C. diff Quik Chek Complete, Abbott).
2) Recherche de facteurs de virulence
Le principal facteur de virulence de C. difficile est la cytotoxine B. La plupart des souches pathogènes sont positives à la toxine A et à la toxine B (A+B+) ou plus rarement négatifs à la toxine A et positifs à la toxine B (A-B+). Un nombre restreint de souches de C. difficile produisent également une toxine binaire. Le locus de la toxine binaire contient deux gènes distinct (cdtA et cdtB). Chez les souches hypervirulentes comme les souches 027/NAP1/BI, on peut démontrer en plus des gènes de la toxine A&B et de la toxine binaire, des mutations sur le gène de régulation négative de la toxine (tcdC), notamment une délétion de 18pb et une délétion sur le nucléotide en position 117. Ces dernières influenceraient la quantité de toxines que la souche peut produire.
Le test consiste
- à rechercher les toxines dans les selles ou sur culture par tests immuno-enzymatique (C. diff Quik Chek Complete, Abbott).
- à évaluer le pouvoir toxinogène de C. difficile par effet cytopathogène sur culture cellulaire MRC5 (méthode de référence).
- à détecter simultanément, par une multiplex, les gènes de la toxine A (tcdA), de la toxine B (tcdB) de la toxine binaire (cdtA et cdtB) et des délétions de 18pb, 39pb, 54pb et d'un nucléotide en position 117 dans le gène de régulation tcdC. (Xpert C. difficile BT, Cepheid, PCR multiplex Facteurs de virulence home made).
3) Investigation en cas d'épidémie hospitalière
A. MLVA
La tehnique de typage appelée MLVA (MultiLocus Variable number tandem repeat Analysis) permet une analyse plus discriminante des souches de Clostridioides difficile comparé à la technique de ribotypage, ce qui permet de distinguer des clones au sein d'un même ribotype. Elle est basée sur l'existence sur le chromosome de C. difficile d'une série de séquences d'ADN répétées en tandem situées à de nombreux endroits différents dans le génome bactérien. Ces régions sont appelées loci. Plusieurs de ces loci, choisis pour leur pouvoir discriminant, sont amplifiés et les tailles des amplicons sont mesurées par électrophorèse capillaire. Lorsque la longueur d'un élément répétitif est connue, on peut calculer le nombre de répétitions.
B. Typage par Whole genome sequencing (WGS)
La technique de typage par WGS permet une analyse encore plus discrimiante des souches de Clostridioides difficile comparé à la technique de ribotypage et de MLVA. Par rapport au MLST (MultiLocus Sequencing Typing) classique pour lequel un nombre limité de gènes (6 ou 7) est considéré, le typage gène par gène (cg- ou wg-) MLST permet de comparer les variations génétiques du core-génome (partie conservée du génome) (cgMLST) ou du génome entier (wgMLST), soit plusieurs centaines ou milliers de gènes.
Conformité de l'échantillon
Souche bactérienne (culture pure) ou selles.
En cas de suspicion d'épidémie ou de résultats discordants, les selles ou souches de patients peuvent être envoyées au CNR après avoir pris contact avec le laboratoire. La souche doit être en culture pure. Elle doit être fraîchement ensemencée sur un milieu approprié. Les selles doivent être gardées à 4°C les premières 72 h et au-delà congelées à -20°C.
Milieux recommandés :
- Gélose profonde
- Boîte au sang sous sachet de type Anaerogen, Compact (Oxoid), Anaerocult p (Merck) ou système similaire
- Milieux préréduits
- Thioglycolate ou tubes genre "port a cult"
Instructions pour le transport
Le transport se fait de préférence dans des conditions d'anaerobiose. Transport à température ambiante si l'échantillon arrive au laboratoire dans les 6 heures qui suivent le prélèvement ou réfrigéré dans un délai inférieur à 72 heures (dépassé ce délai, les selles peuvent être congelées à -20°C).
Formulaires de demande
- FO(CLIN)17 Hors surveillance
- FO(CLIN)18 Buiten surveillance
Délais de réponse
Maximum 10 jours ouvrables.
SAUF :
- La recherche d'effet cytopathogène et de facteurs de virulence par PCR multiplex home made : maximum 42 jours.
- Le typage MLVA ou WGS : maximum 3 mois sur demande justifiée. Le laboratoire expéditeur sera informé par le CNR si la demande n'est pas considérée comme justifiée.